Патент №2495123 - Способ получения модифицированной формы триптофанил-трнк-синтетазы

Изобретение относится к области биотехнологии. Измельчают ткани поджелудочной железы животных и экстрагируют. Отделяют экстракт от жмыха. Осаждают и удаляют примесные нуклеиновые кислоты с помощью стрептомицин сульфата. Повторно осаждают примеси из супернатанта высаливанием сульфатом аммония. Проводят постадийное фракционирование экстракта. На первой стадии фракционирования используют метод ионообменной хроматографии с использованием ДЕАЕ-целлюлозы ДЕ-52. Проводят ступенчатую элюцию буферным раствором, содержащим 25 мМ трис-HCl при pH 7,5, 1 мM ЭДТА, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола и стабилизатор модифицированной формы ТРСазы в виде комплекса субстратов 0,2 мМ L-триптофана и 1,0 мМ Mg-АТФ. Элюирование проводят до достижения значения оптической плотности не выше 0,1 о.е./мл при 280 нм. Удаляют примесные белки буферным раствором, содержащим 0,09М NH4Cl. Очищенную фракцию промывают буферным раствором, содержащим 0,16М NH4Cl. Полученную смесь осаждают сульфатом аммония до достижения 60% насыщения. Центрифугируют и растворяют осадок буферным раствором, содержащим 0,1М NH4Cl. Добавляют к раствору ингибитор протеаз 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) или 5 мМ диизопропилфторфосфата (ДФФ). Проводят вторую стадию фракционирования методом ионообменной хроматографии с использованием ДЕАЕ-целлюлозы ДЕ-52 при ступенчатой элюции с использованием линейного градиента соли хлорида аммония 0,01 - 0,16М. Отбирают фракции с модифицированной формой триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРСазы). Концентрируют целевой продукт высаливанием сульфатом аммония до достижения 100% насыщения. Изобретение позволяет увеличить выход модифицированной формы триптофанил-тРНК-синтетазы до 90% с чистотой 99%. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 10 пр.

Патент №2495123, изображение 1
Патент №2495123, изображение 2

Классификация патента

Код Наименование
МПК C12N 9/00Ферменты, например лигазы (6.); проферменты; композиции их; способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов